PROTOCOLO PARA PRUEBAS DE TETRAZOLIUM EN SEMILLAS DE ORQUIDEAS
(Machado-Neto, NB; Custódio, CC; Hosomi, ST; Seaton, PT; Marks, TR)

1. Pesar de 3 a 5 mg de semillas

2. Colocar las semillas en un microtubo de 1,5 ml

3. Añadir 1,5 ml de solución de sucrosa al 10 %

4. Dejar reposar el microtubo a temperatura ambiente o a 25°C por 24 horas

5. Desechar la solución usando una pipeta Pasteur o una micropipeta

6. Añadir 1 ml de solución de tetrazolium (TZ) al 1 %

7. Colocar en un baño maría a 40°C durante 24 horas

8. Reemplazar la solución de tetrazolium con agua destilada usando una micropipeta. El conteo se debe realizar inmediatamente o se puede almacenar en un refrigerador hasta el momento adecuado.

9. Coloque la solución que contiene las semillas en un porta objetos

10. Coloque el porta objetos en un escáner plano, coloque una regla plástica a un costado del porta objetos para que pueda servir como una escala y escanee la imagen a 3600 dpi. En la parte interna de la cubierta del escáner se debe colocar una hoja de color azul para un mejor contraste.

11. Normalmente todo el cubre objetos se puede observar en la pantalla del computador, aunque si la imagen es muy grande; como alternativa se puede cortar la imagen en segmentos de área conocida.
    

    SOLUCIÓN DE TETRAZOLIUM
    (PREPARADO EN BUFFER DE FOSFATO)
    

    Es importante mantener el pH de la solución de (6,5 – 7,5) para una óptima actividad del tetrazolium (TZ); este puede ser disuelto en un buffer de fosfato.

    Como preparar un litro de solución:
    
    1. Disolver 3,63 g de fosfato monobasico de potasio (KH2PO4) en 400 ml de agua deionizada.

    2.Disolver 7,13 g de fosfato acido de sodio (Na2HPO4) en 600 ml de agua deionizada.
    
    3. Cuando estén completamente disueltas estas soluciones, mezclarlas, luego añadir y disolver el tetrazolium a la concentración deseada por ej. 1 % (peso/volumen - para la solución añadir 1 g de (TZ)).
    
    4. Almacenar la solución en una botella de vidrio (mejor si la botella es de color ámbar para proteger de la luz), en un lugar sin luz y a una temperatura 4°C por un tiempo no mayor a tres meses.
    

NOTA: Cualquier reactivo que se torne de color rosado debe ser desechado.

1. Las semillas se deben lavar con agua destilada

2. Pesar 1 g de 2,3,5 Trifenil cloruro tetrazolium y disolver en 100ml de agua.
Esta solución se debe almacenar en refrigeración en un frasco de color ambar.

3. Tiempos más cortos se pueden usar ver el protocolo de Hosomi y otros.
(2011) SST 39(1) 178 – 189.

Primer plano de semillas de Orchis sancta demonstrando los embriónes rojos oscuros
de semillas viables. foto Khaled Abulaila

Semillas viables (con embriónes rojo oscuro) y semillas no viables (con embriónes pálidos) de Orchis papilionaceae. Las líneas azules de los cuadrados ayudan contar las semillas viables y no viables. foto Khaled Abulaila